酿脓链球菌

一、分类和基因组特征

引起猩红热的酿脓链球菌（ Streptococcus pyogenes ），即 A 群链球菌（ Group A streptococcus, GAS ），为 β 溶血、对杆菌肽敏感、 PYR 阳性，具有兰氏 A 群抗原，在血平板上形成大菌落，是人体的重要致病菌之一，可以引起很多种疾病，因此早期 GAS 还被称为丹毒链球菌（ Streptococcus erysipelatos ）和猩红热链球菌（ Streptococcus scarlatinae ）等。酿脓链球菌属链球菌科（ Streptoccaceae ）、链球菌属（ Streptococcus ）。链球菌属细菌种类繁多，其传统的分类方法主要有以下两种， （ 1 ） 根据血平板上菌落的溶血现象可以分为三种， ① 甲型溶血性链球菌 ( α-Hemolytic streptococcus) ：菌落周围有 1mm~ 2mm 的溶血环，呈草绿色，称甲型溶血或 α 溶血。甲型溶血性链球菌可分为草绿色链球菌（ Streptococcus viridans ）和肺炎链球菌（ Streptococcus pneumoniae ）。草绿色链球菌常常寄生在口腔、胃肠道、女性生殖道，为人体的正常菌群。肺炎链球菌亦称肺炎球菌（ Pneumococcus ），是肺炎的重要致病菌，还可引起中耳炎或脑膜炎，最早被称为肺炎双球菌，由于在液体培养基中形成长链，后来更名为肺炎链球菌。 ② 乙型溶血性链球菌 ( β-Hemolytic streptococcus) ：菌落周围有 2mm~ 4mm 界限分明、完全透明的溶血环，称乙型溶血或 β 溶血，乙型溶血性链球菌致病力强，能引起很多种疾病， ③ 丙型链球菌 ( γ-Streptococcus) ：菌落周围无溶血环，一般不致病，为口腔，鼻腔及肠道的正常菌群； (2) 又根据表面群特异性多糖抗原（兰氏血清学试验），链球菌分为 A 、 B 、 C 、 F 、 G 等 18 个群，其中引起人类感染的 90% 链球菌属于 A 群，而 A 群链球菌大部分是乙型溶血性链球菌，因此还被称为溶血性链球菌（ Streptococcus hemolyticus ）。另外， A 、 C 、 G 群 β 溶血性链球菌可分为两组：大菌落组（直径大于 0.5mm ）和小菌落组（直径小于 0.5mm ）。形成大菌落的 A 、 C 、 G 群化脓性链球菌，具有多种有效的致病机制。而形成小菌落的具有兰氏 A 、 C 、 G 群抗原的 β 溶血性链球菌，在遗传上与化脓性菌株不同，属于咽峡炎群（ Anginosus group ）或米勒链球菌群 ( Streptococcus milleri group) ，目前该菌群包括咽峡炎链球菌，星座链球菌和中间链球菌。该群链球菌具有不同的兰氏抗原，是口腔和生殖道正常菌群的组成部分，有可能参与感染的形成（主要是脓肿），也有可能作为共生菌被分离。

GAS 目前已有 13 个全基因组序列，以 M1 型菌株（ SF370 ）为例 (1) ，其基因组大小为 1 ， 852 ， 442 个碱基对， G ＋ C 含量为 38.5% ，是革兰氏阳性菌中属 G ＋ C% 较低家族中的一员。基因组中共预测了 1 ， 752 个 ORF ，其中有 1 ， 282 个（ 83% ）与其他菌种已有的假想蛋白或同源蛋白相匹配，这些菌种包括枯草杆菌、乳酸乳球菌及其他链球菌。共有 79 个稳定的 RNA 基因，其中包括 6 个 rRNA 操纵子。另外，将近 10% 的 ORF （ 176 个）与前噬菌体（ prophage ）或转座子基因有关，前噬菌体基因组共有四个，分别携带及编码不同的毒力基因如链球菌致热外毒素（ SPE, streptococcal pyrogenic exotoxins ）。这些毒力基因一般位于噬菌体基因组的末端即整合位点附近，而且 G+C 含量在 26%~30% 之间，明显低于临近的噬菌体其他基因或整个染色体的平均 G+C% （ 38.5% ），说明这些基因可能是从其他菌获得 , 另外某些链球菌致热外毒素还与金黄色葡萄球菌的肠毒素具有同源性，但是这些基因的具体来源目前尚不清楚。 GAS 基因组中普遍存在的前噬菌体基因组可以使毒力基因水平转移，这种转移不仅可以产生高致病性菌株，而且对 GAS 的进化也具有非常重要的促进作用。

二、生物安全须知

根据卫生部颁发的《人间传染的病原微生物名录》， GAS 属于危害程度分类第三类细菌，大量的活菌操作及样本检测包括病原体分离纯化、药敏试验、生化鉴定、免疫学试验、 PCR 核酸提取、显微镜观察等操作须在生物安全二级实验室进行。对于非感染性材料的操作可在生物安全一级实验室进行。

三、培养基和培养条件

GAS 为需氧或兼性厌氧。营养要求较高，常规用培养基为含 5 ％脱纤维羊血的 TSA 培养基（ Tryptic Soy Agar ， Difco 公司 ）或哥伦比亚琼脂培养基。初代培养需要 5% CO2 的环境 , 因为富含 CO 2 的空气可促进许多链球菌的生长及溶血性，最适温度 35 ℃ ~ 37 ℃ ，最适 pH 7.4~7.6 。在液体培养基中为絮状或颗粒状沉淀生长。在血平板上，经 37 ℃ 培养 24 小时后可形成灰白色、表面光滑、圆形、凸起、边缘整齐、直径为 0.5mm ～ 0.75mm 的细小菌落，少数菌落表面可呈干涩，菌落周围形成透明的溶血环（图 3-1 ）。虽然有文献报道厌氧条件和选择性培养基（添加磺胺甲基异噁唑）可以提高 GAS 的检出率，但目前尚未得到公认 (2) 。

影响 GAS 检出率的另一重要因素是培养时间，对标本进行分离培养时，首次培养 18~24 小时即可检出 GAS ，如果观察结果为阴性，应再培养 24 小时后重新观察，可明显提高 GAS 的检出率 (3) 。

液体培养基包括 TSB 肉汤（ Tryptic Soy Broth ）和 THB 肉汤（ Todd-Hewitt Broth ）或 BHI 肉汤，可从 Difco 公司购买，也可自行配制葡萄糖磷酸缓冲液肉汤，其中 THB 肉汤特别用于血清分型的 GAS 培养。

图 3-1 GAS 菌落形态 （ 37 ℃ ， 5%CO 2 ， 24 小时 ）

四、形态学特征

链球菌镜下呈球形或卵圆形，直径约 0.5~1.0μm ，呈链状排列，链长短不一，在液体培养基中易形成长链。（图 4-1 ）无芽孢，无鞭毛。多数菌株在培养早期（ 2~4 小时）形成透明质酸荚膜。链球菌易被普通的碱性染料着色，自病灶新分离株为革兰染色阳性，老龄菌或被吞噬后的细菌可转成革兰阴性。

图 4-1 链球菌光镜照片 （ 1000 倍 ）

五、生物化学与生理学鉴定

1 ） β 溶血性链球菌的鉴定

（ 1 ） PYR 试验

PYR 试验检测 PYR （氨基肽酶）的活性，该酶由酿脓链球菌产生，除了罕见的与动物有关的豕链球菌和海豚链球菌，其他的 β 溶血性链球菌不能产生 PYR 。但具有兰氏 D 群抗原的肠球菌可产生 PYR ，容易与酿脓链球菌混淆。快速完成 PYR 试验所需的试剂已有销售。

（ 2 ）杆菌肽（ bacitracin ）敏感试验

尽管可通过兰氏抗原或 PYR 试验快速鉴定酿脓链球菌，但杆菌肽敏感试验有助于将酿脓链球菌与小菌落形态的 A 群链球菌或其他 PYR 阳性的 β 溶血性链球菌区分开来。在血平板上，刮取 3 ～ 4 个纯培养的菌落，并大量接种，将 0.04U 的杆菌肽药片置于培养基表面。 37 ℃ 过夜培养后，药片周围出现任何抑菌环则可鉴定为酿脓链球菌 ( 图 5-1) (4) 。

图 5-1 杆菌肽敏感试验

（ 3 ） VP 试验（ Voge-Proskauer test ）

检测 3- 羟基丁酮产物的 VP 试验可以鉴定具有 A 、 C 、 G 群兰氏抗原的形成小菌落的 β 溶血性链球菌，使之区别于具有相同抗原的产生大菌落的化脓性链球菌。将 1.5ml 培养液含（ 0.5% 蛋白胨， 0.5% K 2 HPO 4 , 0.5% 葡萄糖， pH=7.5 ）分装于小瓶高压灭菌，接种菌后在 35 ℃ 培养 1 ～ 2 天或直至培养液混浊。加入 0.6ml 溶于乙醇的 α 萘酚和 0.2ml 浓度为 40 ％的 KOH, 振荡小瓶。 30 分钟内观察结果，若出现樱桃红色表明阳性反应（弱阳性时出现粉）。

（ 4 ） BGUR 试验

BGUR 试验可检测 β-D- 葡萄糖醛酸苷酶（ BGUR ）的活性，人源的具有 C 群和 G 群兰氏抗原的大菌落 β 溶血性链球菌可产生 BGUR ，而具有相同抗原且形成小菌落的米勒菌群则不产生该酶。因此该试验可区分 C 和 G 群溶血性链球菌的大、小菌落组。

（ 5 ） CAMP 试验

大多数 B 群链球菌可产生可扩散的胞外蛋白（ CAMP 因子），可促进金黄色葡萄球菌的溶血能力，产生显著的协同溶血作用。在含羊血的琼脂平板表面，将待测的链球菌划一条水平直线，将金黄色葡萄球菌（ ATCC25923 ）垂直于水平线划在该平板上，两线不得相接，彼此间隔 3 mm~ 4mm ，在 35 ℃ 大气环境中过夜培养。两种划线交界处出现箭头形状的完全溶血区，即为阳性结果。

（ 6 ）马尿酸水解试验

水解马尿酸也成为推测性鉴定 B 群链球菌的替代试验。该试验的快速操作方法如下：将细菌在 1% 的马尿酸盐水溶液中培养 2h ，通过检测茚三酮水解马尿酸的终产物－甘氨酸，来判定结果。

2 ）非 β 溶血性链球菌的鉴定

如表 5-1 所示，双乙奎丁和胆汁溶解试验可将肺炎链球菌与草绿色链球菌相区分，并根据牛链球菌能在含 40 ％胆汁条件下水解糖苷七叶苷的特性，可将其与大多数绿色链球菌区分开来。另外，非 β 溶血性的 B 群链球菌可通过 CAMP 试验或血清学试验加以鉴别。

表 5-1

a 某些肺炎链球菌可能是 PYR 试验阳性。

b 某些草绿色链球菌胆汁七叶苷试验呈弱阳性。

（ 1 ） Optochin 试验

将含 5μg 的 Optochin( 乙基氢化脱甲奎宁 ) 药片放在涂有少量待测菌株的血平板 1/4 处。在烛罐或 CO 2 孵箱中 35 ℃ 过夜培养，观察有无抑菌环出现。 6mm 药片的抑菌环大于 14mm 或 10mm 药片的抑菌环大于 16mm ，表明有抑菌作用，可鉴定为肺炎链球菌。对出现小抑菌环的菌株，应进一步进行胆汁溶解试验来确认。

（ 2 ）胆汁溶解试验（ Bile solubility test ）

将含有 0.5~1.0 麦氏的待测细菌悬液 0.5ml ，加在两个试管（ 13mm × 100mm ）中。其中一个管中加等量（ 0.5ml ）的 2% 去氧胆酸盐（胆汁），另一个管中加 0.5ml 的生理盐水作为对照。在 35 ℃ 培养不超过 2h ，胆汁溶解试验阳性结果为去氧胆酸溶液变得清亮，而对照无任何变化。另外，还有文献报道用 10% 去氧胆酸盐，直接将一滴胆汁溶液滴在待测细菌的一个单菌落上，平板可在室温或 35 ℃ 有氧培养箱中放置 15 分钟，直至溶剂变干。注意保持平板水平放置，以免溶剂流淌冲掉菌落。肺炎链球菌的菌落将会消失或变得扁平，而具有胆汁抗性的链球菌则不受影响 (5) 。

（ 3 ）胆汁七叶苷试验（ Bile Esculin Test ）

在平皿或斜面的胆汁七叶苷培养基上接种 1 ～ 3 个待测菌株的菌落，置于 35 ℃ 大气环境中培养，培养时间不超过 48 小时。平板培养基明显变黑或斜面培养基至少有一半变黑，即为阳性结果，可鉴定为牛链球菌。少数草绿色链球菌该试验呈阳性或弱阳性。鉴定从严重感染患者（如心内膜炎）分离到的细菌时，应更全面鉴定其生化和生理学特征，而不应仅仅根据胆汁七叶苷试验鉴定牛链球菌。

3 ）微量生化试验

API 20 Strep （ BioMérieux ， REF20600 ）是专门用于鉴定链球菌和相关细菌的鉴定系统。其试剂盒共包括 20 个生化反应，可测定酶活性或糖发酵（图 9-2 ）。

六、血清学鉴定

1 ）兰氏抗原鉴定

2 ）抗体检测

3 ）血清学分型

七 、 基因分型方法

1 ） emm 分型 ：

2 ） sof 基因分型

八、鉴定方法

1 ）直接检测

标本可直接经过涂片和革兰氏染色，检测出链球菌。

或通过商品化的快速抗原检测试验（ Rapid antigen detecting test, RADT ）检测样品中的链球菌，但对结果阴性的样品需经过传统的分离培养来进一步验证。

2 ）分离培养

血液标本需先经肉汤培养基增菌培养，其他标本接种血琼脂平板并涂片染色镜检。对于混浊脑脊液可直接涂片，不混浊的则以 3000rpm 速度离心 15 分钟后取沉淀涂片染色检查。初代分离用 5 ％ CO 2 环境， 35 ～ 37 ℃ 培养 24 小时，观察菌落性状，挑选产 β 溶血的可疑菌落进行纯培养，通过涂片及革兰氏染色后镜下观察确定是否为链球菌。若未发现可疑菌落，需进一步培养 24 小时后再观察。

3 ）鉴定 β 溶血性链球菌

（ 1 ）血清学试验 ( 兰氏抗原分群 ) ：使用 Streptococcal Grouping Kit (OXOID) 检测 β 溶血性链球菌的兰氏抗原，如前所述， B 群链球菌为无乳链球菌， F 群链球菌属咽峡炎或米勒链球菌群。但 A 、 C 、 G 群链球菌需通过生化及生理学进一步鉴定。通过生化反应（表 14-1 ）可以区分具有上述兰氏抗原的细菌

表 14-1 人源 β 溶血性链球菌的鉴别特征

（ 2 ）生化及生理学试验（详见 “ 生物化学与生理学鉴定 ” 部分）

① 酿脓链球菌 : 经兰氏分群确定 A 群或 PYR 试验得到阳性结果后，再进行杆菌肽敏感试验，若对杆菌肽敏感则鉴定为酿脓链球菌。

② 其他 β 溶血性链球菌鉴定如表 14-1 。

③ 或使用 API 20 Strep 鉴定菌种。

传染病诊断室

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